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[导读] 准确观察到细胞内部的活动,一直都是科学家们孜孜以求,费心探索的一个目标。最开始科学家们尝试的是体外成像,但是体外成像无法满足天然环境下描绘生物过程的需要,因此他们开始逐渐从体外观测转向对体内生物体过程

 准确观察到细胞内部的活动,一直都是科学家们孜孜以求,费心探索的一个目标。最开始科学家们尝试的是体外成像,但是体外成像无法满足天然环境下描绘生物过程的需要,因此他们开始逐渐从体外观测转向对体内生物体过程的研究。

 
体内成像,也就是活体成像技术发展至今,已经可以称为活体荧光成像了,采用荧光成像具有操作简单,结果直观,灵敏度高等优点,但虽然如此,活体荧光成像依然存在许多问题,首先就是信号水平不高,假阴性较多的问题,2008年,也就是细胞成像技术被《Nature Methods》评为年度技术的那一年,荧光显微技术焕发出了全新的光彩,超高分辨率荧光显微技术诞生了。
 
传统光学显微镜受限于光的波长,对于200nm以下的小东西只能摇头兴叹。虽然电子显微镜可以达到纳米级的分辨率,但通电的结果容易造成样品的破坏,因此能观测的样本也相当有限。分子生物学家虽然可以做到把若干想观察的蛋白质贴上荧光卷标,但这些蛋白质还是经常挤在一块,在显微镜下分不出谁是谁。
 
之后几年高分辨率荧光显微镜跨越了一大步,使得研究者可以从纳米级观测细胞突起的伸展,从而宣告200—750纳米大小范围的模糊团块的时代结束了。比如利用光敏定位显微镜:PALM可以用来观察纳米级生物,相较于电子显微镜有更清晰的对比度,如果给不同蛋白接上不同的荧光标记,就能用来进一步研究蛋白质间的相互作用。
 
2006年华裔科学家庄小威研究组开发了一种随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)的技术。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白质复合体分子。这一方法基于光子可控开关的荧光探针和质心定位原理,在双激光激发下荧光探针随机发光,通过分子定位和分子位置重叠重构形成超高分辨率的图像,其空间分辨率目前可达20nm。STORM虽然可以提供更高的空间分辨率,但成像时间往往需要几分钟,同时还不能满足活体实时可视的成像的需要,发展空间很大。
 
与此同时,另外两个研究组也报告了新方法提高了分辨率,他们的技术称为荧光激活定位显微镜技术,简称FPALM。2007年,研究人员证实FPALM可以用来检测脂质筏中聚集的蛋白。
 
自此之后,荧光显微技术飞速发展,研究人员首先将PALM和单粒子失踪结合起来探测肝细胞膜蛋白的运动,之后庄小威研究组又展示了3D STORM成像,证明这比三维空间衍射极限空间分辨率更好。
 
除此之外来自哈佛大学的谢晓亮教授将SRS显微技术与核磁共振成像(MRI)技术联合起来,从而能快速灵敏的捕捉活体组织中分子运动,比如血细胞挤压通过血管的过程。
 
这项技术镜头分辨程度达到亚细胞水平,可记录下蛋白、脂肪及细胞内液的情况。由于SRS显微镜可以探测到原子间化学键的共振,因此无需荧光标记。研究人员认为SRS显微镜可以在肿瘤摘除手术方面有所帮助,加快手术进程。传统的样本分析需要花费约20分钟,SRS 显微镜几乎可以做到实时扫描。
 
2010年双光子显微镜的出现让大脑成像系统有了进一步的发展,双光子显微镜可探测至大脑内部1毫米的深度,这超过普通光学显微镜的十倍。而利用荧光传感器探测神经元活动则使数据更加稳定可靠。这些新技术与制备工艺的完美结合为人类研究大鼠和小鼠的大脑提供了物理的和光学的方法,从而使活体动物完整大脑组织的神经信号传递的可视性得以实现。
 
另外在肿瘤组织成像方面,来自美国的科学家们利用一种称为非线性干涉成像技术(NIVI)的新型显微检测技术对大鼠乳腺癌细胞和组织进行扫描在不到五分钟的时间内生成了易读的彩色编码组织图像,图像中肿瘤边界清晰,准确率高达99%。
 
今年,来自加州大学旧金山分校研究人员又报道了一种活体肺组织实时成像技术——高速双光子成像(video-rate,two-photon imaging),这种技术能首次在不影响肺组织正常生理功能的情况下,实现对细胞活动进行实时成像观测。而来自美国能源部布鲁克海文国家实验室的研究人员开发了一种新型的RatCAP PET活体动物成像系统,这一新型设备为神经科学家们研究处于清醒和活动状态下的动物大脑功能和行为提供了新工具。
 
除此之外,值得重点关注的还有单层光显微技术(light sheet microscopy),这一显微技术利用薄的,扁平的单层光照射生物样品,从而可以对数毫米的样品进行观察,并能进行荧光成像。
 
利用这种技术,研究人员可以观察细小生物体和胚胎组织。他们还将双光子激活与单层光显微技术结合在了一起,从而获得了能进行高分辨率,高穿透深度(可以观察到三维样品内部),以及高成像速度的活体生物成像的新技术。 
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