利用PCR仪进行实验时常见问题分析及解决方法

PCR仪已经成为分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域广泛应用的一种仪器。PCR仪在操作中常会遇到哪些问题呢？该如何解决呢？

1、PCR在产物序列中引入了错误，这大多是由于聚合酶忠实性低或者循环数太多，这时需要使用带有校正活性的热稳定聚合酶，同时降低循环数。此外，四种dNTP的浓度不同也会出现该问题，此时应制备新的浓度相同的dNTP混合物。

2、PCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象。出现这样的问题，则需要进行细致的分析，因为引起该问题的可能很多。可先检查是否模板质量问题，如有降解等，模板应避免反复冻融。也有可能是抽提RNA时有污染，则需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特异性扩增引发该问题，可提高退火温度，少循环次数。电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变、电泳时电压太高、电泳液过久没换，电泳胶脏了等都可能引发该问题。如果不是由上述原因引起，则进一步检查加样量是否过大，制胶过程中胶孔是否制好，EB是否冲洗干净、模板中是否混有基因组DNA或蛋白等。也需考虑是否扩增的条件不合适。针对具体原因再采取相应的措施。

3、PCR产物何时需要用凝胶纯化，何时不需要？当凝胶分析扩增产物只有一条带时，则不需要使用凝胶纯化。当可见其他杂带时，则可能是积累了大量引物的二聚体，在克隆前需要做凝胶纯化。

4、如果实验中没有回收到目的片段，则需要继续进行对照实验。包括涂布未转化的感受态细胞、转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率、用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞，按照指定的实验步骤进行。

5、实验中出现假阳性扩增该怎么办？这是扩增系统受到污染的表现，应通过检查排除污染源。首先考虑是否为试剂污染，可将试剂分装好直接置于PCR仪中扩增进行判断。其次要考虑是否为实验室污染，可更换所用的移液器、吸咀管（离心管）等，将试验中的关键步骤转移到一个新的环境中，判断是否为实验室污染。如果是则需要对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，保持良好的通风、清洁等。此外，还要考虑是否为采样污染，一般表现为一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复。解决方法为尽量使用一次试管及吸咀取样。

6、实验中出现假阴性扩增该怎么办？首先要考虑是否为仪器故障，仪器应正常运转，尤其要注意加热温度及各管间的差异是否符合实验要求，是否出现误差等。其次要考虑是否为试剂失效或无效引起，使用有效的试剂。