Nat Commun：利用CRISPR-Cas9绘制DNA突变

在一项新的研究中，来自美国弗吉尼亚联邦大学的Jason Reed博士和同事们开发出一种新的纳米绘图(nanomapping)技术，这可能引发致病性基因突变诊断和发现方法变革。这种新技术将高速原子力显微镜(AFM)与一种基于CRISPR的化学条形码技术结合起来，几乎与DNA测序那样准确地绘制DNA图谱，同时更快地处理大片段的基因组。更重要的是，这种技术能够由在普通的DNA播放器中发现的部件供电。相关研究结果于2017年11月21日在线发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle”。

人类基因组由数十亿个DNA碱基对组成。一旦松散开来，它长将近6英尺。当细胞发生分裂时，它们必须为新的细胞拷贝它们的DNA。然而，有时这种DNA的多种片段被错误地拷贝或者在错误的位点连接在一起，从而产生导致癌症等疾病的基因突变。DNA测序是如精确以至于它能够分析DNA的单个碱基对。但是为了分析大片段的基因组来发现基因突变，技术人员必须确定数百万个微小的序列，然后利用计算机软件将它们拼接在一起。相反之下，诸如荧光原位杂交(FISH)之类的生物医学成像技术仅能够在几万个碱基对的分辨率下分析DNA。

Reed的这种新的高速AFM方法能够在数十个碱基对的分辨率下绘制DNA图谱，同时创建分辨率高达一百万个碱基对的图片。而且它使用的样品数量仅是DNA测序所需的一小部分。

Reed说，“DNA测序是一种强大的工具，但是它仍然具有高昂的成本，并有一些技术和功能上的局限性，从而使得难以高效地和准确地绘制出大片段的基因组。我们的方法填补了DNA测序和其他的分辨率较低的物理图谱技术之间的差距。它能够作为一种独立的方法加以使用，也能够作为DNA测序的补充，降低在DNA测序过程中将小片段的基因组拼接在一起时的复杂性和错误。”

AFM通过它的微针(microscopic stylus)与被研究的材料的表面相接触来绘制出这种材料表面的图片。然而，传统的AFM对医学应用来说太慢了，因此，它主要由材料科学的工程师使用。

Reed说，“我们的设备与AFM的工作方式相同，但是让样品以更大的速度经过这种微针，并且利用光学仪器检测这种微针与材料表面上的分子之间的相互作用。我们能够达到与传统的AFM一样的观察细节，但是能够比后者快一千倍地处理材料。高速AFM非常适合于一些医学应用，这是因为它能够快速地处理材料，并且提供比同类的成像方法高上百倍的分辨率。”

提高AFM的速度仅是Reed和他的同事们必须克服的一个障碍。为了真正地鉴定出DNA中的基因突变，他们必须开发出一种将标志物或标签放置在DNA分子表面上的方法，这样他们就能够识别出这些分子中的模式和不规则性。他们还利用CRISPR技术开发出一种巧妙的化学条形码方法。

最近因在基因编辑方面取得的进展，CRISPR/Cas9系统成为了很多新闻报道的头条。科学家们利用向导RNA对酶Cas9进行“编程”，从而在准确的位点上切割DNA，随后细胞能够自我修复这种DNA损伤。Reed团队改变这种酶的化学反应条件以至于它仅结合到DNA上，但并不切割它。

Reed说，“鉴于Cas9是一种在物理上比DNA分子更大的蛋白，它对这种条形码应用来说是非常完美的。我们惊讶地发现它结合到DNA分子上的效率接近90%。而且因为观察Cas9是比较容易的，所以你能够在DNA的模式中发现基因突变。”

为了证实这种技术的有效性，这些研究人员绘制出淋巴瘤患者的淋巴结活组织样品中存在的基因易位。这些基因易位在淋巴瘤等血癌中特别普遍，但是也存在于其他的癌症中。

尽管这种技术具有很多潜在的用途，但是Reed和他的团队正在专注于医学应用。他们当前正在基于现存的算法开发软件以便能够分析长一百万个碱基对及以上的DNA片段中的模式。一旦开发完成，就不难想象在病理实验室中，这种鞋盒大小的仪器就有助诊断和治疗与基因突变相关的疾病。