分光光度计如何定量核酸?分光光度计有何使用注意事项?

时间：2022-03-03 11:30:32

关键字：分光光度计指数光度计

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[导读]为增进大家对分光光度计的认识，本文将对分光光度计的应用以及分光光度计使用注意事项予以介绍。

分光光度计具有重要应用，不管是在工业环境还是实验室中，都有分光光度计的身影。为增进大家对分光光度计的认识，本文将对分光光度计的应用以及分光光度计使用注意事项予以介绍。如果你对分光光度计具有兴趣，不妨继续往下阅读哦。

一、分光光度计用于核酸定量

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

二、分光光度计使用注意事项

1)为了防止光电管疲劳：不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。

2)比色皿的使用方法：

①拿比色皿时：手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

②清洗比色皿时：一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如，比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液(1:2)浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。

③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干：以保护透光面。

④测定有色溶液吸光度时：一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

⑤在实际分析工作中：通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。分光光度计的维护和保养分光光度计是精密仪器，正确安装、使用和保养对保持仪器良好的性能和保证测试的准确度有重要作用。

1.对仪器工作环境的要求分光光度计应安装在稳定的工作台上，(周围不应有强磁场, 以防电磁干扰)，室内温度应保持在(10～30)℃。室内应干燥，相对湿度宜控制在<85 %，室内应无腐蚀性气体，光线不宜过强。

2.仪器保养和维护方法

(1)仪器工作电压一般为220V，允许±10 %的电压波动。为保持光源灯和检测系统的稳定性，在电源电压波动较大的实验室最好配备稳压器。

(2)为了延长光源使用寿命，在不用时不用开光源灯。如果光源灯亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯。更换后要调节好灯丝位置，不要用手直接接触窗口或灯泡，避免油污沾附，若不小心接触过，要用无水乙醇擦拭。